Собор Бориса і Гліба був побудований архітектором Григорієм Борисовим на місці однойменної церкви в 1522-1524 роках в московських традиціях. Храм – чотиристовпний, одноглавий, з простими і ясними формами, лаконічним асиметричним силуетом, шоломоподібним куполом і щілиноподібними вікнами.

Борисоглібський собор протягом 400 років свого існування багато разів переписувався: в XVII столітті, в 1783 році, 1842 і 1912 роках. Кожна наступна реставрація не щадила старих шарів живопису. Її нерідко збивали зі стін, готуючи кожен раз новий, найбільш щільний і зручний ґрунт.

У 1956 році архітектором Б. А. Вогневим при розборі пізньої цегляної закладки головною вівтарної ніші був виявлений візерунок з великих стилізованих пагонів на охряном тлі (кінець XVII століття). Крім того, в тому місці, де розташовується гробниця засновників обителі Феодора і Павла, Огнев знайшов цікаву композицію кінця XVII століття. В ніші є зображення Спаса Оглавного, патронів монастиря Бориса і Гліба та коліноприклонних Федора і Павла, а на арці – отця Бориса і Гліба, князя Володимира Святого, і Леонтія Ростовського.

При настоятелі монастиря Варлаама в 1783 році інтер'єр храму був переписаний з допомогою клейових фарб, а в 1842 році в тому ж стилі поновлен вдруге. Останнє відновлення собору проводилося в 1912 році (до 300-річного ювілею Дому Романових) під керівництвом спецкомісії на чолі з Н.В. Султановым. Команда художника Ф. Е. Єгорова розписала храм маслом в «російсько-візантійському стилі». Багато етюди виконані за малюнками В. М. Васнецова.

Іконографічна концепція розпису не слід стародавніми канонами. Розпис представлена великими композиціями, розміщеними в розкішно орнаментовані рами з кіл, хрестів і стилізованих пагонів, в яскравій колірній гамі яких використано багато срібла і золота.

У куполі – «Вседержитель», в простінках барабана між віконними прорізами – 8 архангелів з зерцалами, внизу барабана – 12 апостолів у колах, на вітрилах – євангелісти. На 5 склепінні зображено «Дні творіння». На стовпах – фігури руських князів (Володимира, Гліба, Бориса, Олександра Невського та інших). На стіні у верхній частині – «Неопалима купина» і «Успіння», у нижній – «Собор Святий Отець». На північній стіні вгорі можна побачити «Воздвиження хреста» і «Бачення Єремії», внизу – «Нагірна проповідь».

У полукуполе центрального вівтаря ілюстровано Христос у вбранні священика і 7 апокаліпсичних старців. «Положення в труну» і «Воскресіння» розташовуються на стіні між вікнами. Над областю горнього місця – 12 апостолів і 2 ангели з рипідами. У зводі основного вівтаря – «Невидиме око». У консі дьяконника – «Спас на убрусе», на стінах – Авраамій, Гнат, Яків та інші святі. У консі жертовника зображена «Богоматір Знамення» разом з ангелами, на стінах – московські митрополити, серед яких Олексій, Петро, Пилип та інші. На заалтарных стовпах – 3 вселенських святителя, патріарх Ювеналій, Микола Чудотворець, Кирило і Мефодій і Феодосій Чернігівський.

Вызолоченный червоним золотом іконостас, що складається з 6-ти ярусів, відтворений у 1912 році І. Звонаревым, не зберігся.

В кутку храму встановлено раку з мощами прабатьків монастиря Феодора і Павла. Поверхня її посеребрена, декорована характерним для XVII століття килимовим орнаментом із квітів гвоздики і грон винограду. На бічних стінках раки можна побачити 10 позолочених карбованих медальйонів круглої форми, на 2-ух з них вціліла літопис, в якій є відомості, що вказують на те, що раку була виконана за патріарха Йосифа.

З ростовського Борисоглібського собору бере свій початок унікальний пам'ятник давньоруського шиття – «Прапор Сапіги», що датується початком XVII століття.