Вознесенський собор розташований в центрі Знам'янського монастиря. Його історія почалася ще в 17 ст., коли осташковские стариці, отримавши благословення патріарха Питирима, у 1673 р. звернулися до царя з проханням про дозвіл влаштувати жіночий монастир з церквою на честь Знамення і з приділом на честь святого пророка Іллі. Грамота від государя була отримана 12 червня 1673 р. 25 вересня 1673 р. осташковским воєводою Евреевым Іваном Івановичем було відведено ділянку землі для будівництва монастиря і храму. Ігуменею монастиря стала стариця Євпраксія.

Відомостей про те, як і коли будувалася перша дерев'яна церква монастиря не збереглося. Але через 12 років з моменту заснування монастиря (1692 р.) замість дерев'яної Знам'янської церкви з боковим вівтарем святого пророка Іллі, яка надійшла до того часу у ветхість, була зведена нова, теж дерев'яна), але більш містка Вознесенська церква з приділом Знамення Божої Матері.

Після зняття в 1729 р. заборони на будівництво кам'яних будівель ігуменя Євфимія вирішила почати в обителі будівництво кам'яного храму замість колишнього дерев'яного. Завдяки допомозі вкладників, у т. ч. і імператриці Анни Іоанівни, до 1734 р. були побудовані межі кам'яного храму і освячені ігуменом з Ниловой Пустелі Аврамием.

За допомогою різних благодійників до 1748 р. Вознесенський храм був добудований. У 1750 р. храм був прикрашений вызолоченным різьбленим іконостасом з вправного писаними новими іконами. У 1748 р. над західним входом в храм була збудована кам'яна дзвіниця.

Новозбудована церква була одноглавої. Храм і прибудови були покриті тесом. Шатрова дзвіниця мала шість дзвонів. Біля церкви були влаштовані паперті в чотирьох місцях. При межах перебували казенна і ризничная намети, келарная і хлібна. Іконостас головного храму мав чотири яруси. В кінці 18 ст. Вознесенський собор мав п'ять голів і боковий вівтар на честь Усікновення Глави Іоанна Предтечі і Знамення Пресвятої Богородиці. Церква, дзвіниця і прибудови були покриті залізом; на дзвіниці було 8 дзвонів.

У 1803 р. у храмі Вознесіння замість колишнього іконостасу був встановлений новий різьблений іконостас. У 1814 р. в прибудові Усікновення глави Іоанна Предтечі також влаштували новий вызолоченный різьблений іконостас, у 1820 р. іконостас замінили і в прибудові Знамення Божої Матері. У 1821 р. цей іконостас був визолочені червоним золотом, в його клейма були написані нові ікони, колишній іконостас продали в цвинтар Черенчицы. У 1825 р. стіни храму Вознесіння були прикрашені живописом. У 1829 р. був перебудований вівтар з переробкою куполка.

Пожежа 1868 р. знищив все внутрішнє оздоблення храму, в тому числі і дах з главами. Залишилися лише стіни церкви. Відновлення Вознесенської церкви йшло поступово. У тому ж році були встановлені нові іконостаси в боковий вівтар храму. У 1873 р. престол головного храму був освячений архієпископом Тверським і Кашинским, высокопреосвященным Филофеем.

Спостерігав за перебудовою храму місцевий технік Демидов. Але в 1888 р. він помер і його роботу продовжив архітектор Кузьмін і молодий виробник кам'яних робіт Суровков Іван Миколайович. Роботи по перебудові були завершені в 1890 р., 2 лютого того ж року був освячений правий боковий вівтар.

Архітектурний стиль нової теплою монастирської церкви вийшов змішаним. Красу інтер'єрів храму надають стрілчасті склепіння, що спираються на середні стовпи і прикрашені колонами по кутах. Зовні храм прикрашають виступи з карнизами. Решітки вікон і дверей мали ошатний малюнок. Дзвіниця завершувалася пірамідальним шпилем, який був оббитий білою бляхою в шашечку. У 1893 р. була завершена внутрішня оздоблення вівтарів при холодному храмі.

Після закриття монастиря в 1928 р. у приміщенні храму розмістився зерносклад. За час війни суттєвих змін у життя храмі не сталося. У 1947 р. на прохання віруючих була відкрита зимова частина храму. У неї були перенесені мощі преподобного Ніла. Після передачі храму віруючим, він був відремонтований і заново розписаний тверскими, осташковскими і московськими іконописцями. Для мощей преподобного Ніла була виготовлена вызолоченная раку, а також сень, де вони перебували до 9 липня 1995 р., коли їх урочисто перенесли у знову відкрилася Нілова пустель. У Знам'янському соборі були залишені лише частинки мощей преподобного.

В даний час храм є чинним.